Ultrasensitive and rapid diagnostic tool for detection of Acanthamoeba castellanii

Acanthamoeba keratitis is a devastating infectious disease of the cornea caused by an opportunistic amoeba, Acanthamoeba castellanii. It is poorly recognized, and diagnostic delays can lead to irreversible damage to the vision. The gold standard for diagnosis has been a sample culture that lasts approximately 2 weeks. Nevertheless, the essence of time has led to the need for an accurate and fast technique to detect A. castellanii from a sample. We developed both traditional and quantitative real-time-PCR-based methods to detect A. castellanii in less than 3 hours and with the sensitivity of one amoeba. Diagnostic laboratories can select the best-suited method for their purposes from 2 comparable methods. The correct treatment can be initiated from the emergency room when the diagnosis has been made quickly within a few hours, hence saving the patient from long-term complications.publishedVersionPeer reviewe

The role of carbonic anhydrase VI in bitter taste perception : evidence from the Car6(-/-) mouse model

Peer reviewe

Biochemical and Biophysical Characterization of Carbonic Anhydrase VI from Human Milk and Saliva

Carbonic anhydrases (CA, EC 4.2.1.1) catalyze the hydration of carbon dioxide and take part in many essential physiological processes. In humans, 15 CAs are characterized, including the only secreted isoenzyme CA VI. CA VI has been linked to specific processes in the mouth, namely bitter taste perception, dental caries, and maintenance of enamel pellicle, and implicated in several immunity-related phenomena. However, little is known of the mechanisms of the above. In this study, we characterized human CA VI purified from saliva and milk with biophysical methods and measured their enzyme activities and acetazolamide inhibition. Size-exclusion chromatography showed peaks of salivary and milk CA VI corresponding to hexameric state or larger at pH 7.5. At pH 5.0 the hexamer peaks dominated. SDS- PAGE of milk CA VI protein treated with a bifunctional crosslinker further confirmed that a majority of CA VI is oligomers of similar sizes in solution. Mass spectrometry experiments confirmed that both of the two putative N-glycosylation sites, Asn67 and Asn256, are heterogeneously glycosylated. The attached glycans in milk CA VI were di- and triantennary complex-type glycans, carrying both a core fucose and 1 to 2 additional fucose units, whereas the glycans in salivary CA VI were smaller, seemingly degraded forms of core fucosylated complex- or hybrid-type glycans. Mass spectrometry also verified the predicted signal peptide cleavage site and the terminal residue, Gln 18, being in pyroglutamate form. Thorough characterization of CA VI paves way to better understanding of the biological function of the protein.</p

Biochemical and Biophysical Characterization of Carbonic Anhydrase VI from Human Milk and Saliva

Carbonic anhydrases (CA, EC 4.2.1.1) catalyze the hydration of carbon dioxide and take part in many essential physiological processes. In humans, 15 CAs are characterized, including the only secreted isoenzyme CA VI. CA VI has been linked to specific processes in the mouth, namely bitter taste perception, dental caries, and maintenance of enamel pellicle, and implicated in several immunity-related phenomena. However, little is known of the mechanisms of the above. In this study, we characterized human CA VI purified from saliva and milk with biophysical methods and measured their enzyme activities and acetazolamide inhibition. Size-exclusion chromatography showed peaks of salivary and milk CA VI corresponding to hexameric state or larger at pH 7.5. At pH 5.0 the hexamer peaks dominated. SDS- PAGE of milk CA VI protein treated with a bifunctional crosslinker further confirmed that a majority of CA VI is oligomers of similar sizes in solution. Mass spectrometry experiments confirmed that both of the two putative N-glycosylation sites, Asn67 and Asn256, are heterogeneously glycosylated. The attached glycans in milk CA VI were di- and triantennary complex-type glycans, carrying both a core fucose and 1 to 2 additional fucose units, whereas the glycans in salivary CA VI were smaller, seemingly degraded forms of core fucosylated complex- or hybrid-type glycans. Mass spectrometry also verified the predicted signal peptide cleavage site and the terminal residue, Gln 18, being in pyroglutamate form. Thorough characterization of CA VI paves way to better understanding of the biological function of the protein.publishedVersionPeer reviewe

Pentraxin -Carbonic anhydrase CA VI: A novel multidomain protein

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Hiilihappoanhydraasi- proteiinit (carbonic anhydrases, CAs) toimivat kudoksien ja nesteiden pH:n säätelyssä katalysoiden CO2 + H2O   HCO3− + H+ reaktiota. Hiilihappoanhydraasit ovat eliölajeille tärkeitä proteiineja, joiden rakenne ja toimintaympäristö vaihtelevat eri isoentsyymeillä. CA VI on erittyvä proteiini, jota on löydetty syljestä ja äidinmaidosta. CA VI – proteiiniin mm. sammakoilla, kaloilla ja kanalla on kiinnittynyt pentraksiinidomeeni, jonka tarkkaa merkitystä ei vielä tiedetä. Työn tavoitteena on tutkia hiilihappoanhydraasi VI -entsyymin esiintyvyyttä eri lajeilla, rakennetta ja rakenteen konservoituneisuutta eri lajien kesken bioinformatiikan menetelmin. Tavoitteena on valmistaa konstrukti proteiinin tuottamista varten bakteeri- ja hyönteissoluissa käyttäen molekyylibiologian menetelmiä, sekä tutkia miten CA6 geenin hiljentäminen vaikuttaa alkuvaiheen kehityksessä seeprakalojen fenotyyppiin.Tutkimusmenetelmät: Tietokannoista löytyvien CA VI proteiinisekvenssien tarkastelu toteutettiin bioinformatiikan menetelmillä. Molekyylibiologisia menetelmiä käyttäen valmistettiin konstrukti seeprakalan CA VI proteiinin tuottoa varten. Seeprakalojen fenotyyppejä vertailtiin alkioiden kehityksen vaiheiden tutkimuksessa histologian menetelmin. Tutkimustulokset: Sekvenssien rinnastus ja rakenteen analyysit osoittivat kohtia, joissa oli useampia konservoituneita aminohappoja. Yksi konservoituneista alueista sisälsi monille lajeille yhteisen glykosylaatiokohdan. Proteiinin 3D rakenteella tarkasteltuna havaittiin proteiinin aktiivisen kohdan voimakas konservoituminen eri lajien kesken. Proteiinin tuottoa varten valmistettiin konstrukti, jonka sisältämän seeprakalan CA VI -proteiinin nukleotidisekvenssi varmistettiin. Seeprakalojen CA6 geenin hiljentämisen jälkeen alkioiden ja kehittyvien poikasten näytteissä ilmeni morfologisia muutoksia uimarakkulassa ja vatsan alueella.Johtopäätökset: Analyysit vahvistivat CA VI proteiinin olevan eritetty proteiini, johon on liittynyt signaalipeptidi. Konservoituneiden aminohappojen joukosta löytyi alue, jossa useimmista sekvensseistä löytyy kohta glykosylaatiolle. Rakenteen 3D malli osoitti hyvin sekvenssien konservoituneet alueet. Muutamilla lajeilla CA VI proteiiniin liittyneen pentraksiinin toimintaa ei vielä tunneta. Proteiinin tuottoa varten tehtiin konstrukti, jonka CA VI proteiinia koodaava sekvenssi todettiin bioinformatiikan menetelmällä oikeaksi. Seeprakaloilla CA6 geenin hiljentäminen aiheutti epämuodostumia uimarakon ja vatsan alueella.  ABSTRACTBackground and aims: Carbonic anhydrases (CAs) participate in the maintenance of pH homeostasis catalyzing the reversible hydration of carbon dioxide CO2 + H2O   HCO3− + H+. CAs is fundamental to a wide array of physiological processes in species and driving the diversification of CA isoforms in different environments. The CA VI is a secreted protein, found in saliva and breast milk. In some species, such as frogs, fish and chicken a part called pentraxin is attached to CA VI – protein. A function of this pentraxin is not known. In the present study, we investigated the characteristics of CA VI in different species.  The alignment of sequences, the structure of protein and conservation among different species were observed using bioinformatics methods. The other focus on this study was to build a construct for zebrafish CA VI protein production in bacterial and insect cells and to observe the knockdown zebrafish embryonic development in early states using molecular biology and histological methods.Methods: The CA VI protein sequences found in the databases aligned and studied with bioinformatics methods. The molecular biology methods used to build the construct for the protein production of zebrafish CA VI and to study the knockdown effect in zebrafish embryos. Results: The alignment and the analysis of CA VI structure showed the regions of conserved amino acids in different species. One of these regions included the N-glycosylation site found in most of the studied sequences. The study of the 3D structure showed strong conservation at the active site of the protein. The construct has built for the zebrafish CA VI protein production. The template sequence of the construct verified with sequencing. The samples from the CA6 knockdown zebrafish embryos and fry showed changes in morphology of the swim bladder and the stomach area.Conclusions: The analysis confirms that the CA VI is a secreted protein having a signal peptide, and the N-glycosylation site predictions gave novel information about the conserved N-glycosylation site found in different species sequences. The visualizing tool proved to be very helpful of showing the conserved regions in 3D structure. The function of the attached pentraxin part remains unknown. A construct for zebrafish CA VI protein production was produced. The sequencing results verified with bioinformatics methods that the template codes the correct CA VI protein. The morphology results showed the malformation of the swim bladder and stomach area of the CA6 knockdown zebrafish

Tietojenkäsittelyn opetus kosketuksen avulla

Suomen Kuurosokeat ry:n Tieto- ja viestintäteknologian tukipalveluiden IT-koulutuksessa käytetään osana ryhmäkoulutusta toiminnallista näköä ja kuuloa täydentäviä tuntoaistiin perustuvia kuvailu-, palaute- ja ohjeistustapoja tietojenkäsittelyn opetuksessa. Niillä täydennetään ja/tai korvataan kuulonäkövammaisten asiakkaiden kuulon ja/tai näön kautta saamaa tietoa. Olen työskennellyt Suomen Kuurosokeat ry:n Tieto- ja viestintäteknologian tukipalveluissa IT-kouluttajana vuodesta 2007 lähtien ja kuulun kouluttajatiimiin, jossa lisäkseni työskentelee toinen IT-kouluttaja ja viestintäkouluttaja. Tutkimukseni on laadullinen toimintatutkimus. Tutkimus on tehty vuonna 2015 ja sen tarkoitus on kuvata, kuinka IT-koulutuksen kehittämä ryhmäkoulutusmalli käytännössä toteutuu ja millä tavalla tuntoaistiin perustuvat menetelmät toimivat opetustilanteessa. Tiedonkeruumenetelmä on videointi. Aineistona olen käyttänyt IT-ryhmäkoulutuksen koulutusviikoilla kevään 2015 aikana kuvaamiani videoita opetustilanteista. Kuurosokea on henkilö, joka ei näe eikä kuule lainkaan. Nimitystä käytetään myös henkilöistä, joilla on jonkin verran jäljellä olevaa toiminnallista näköä ja/tai kuuloa. Ympäröivän yhteiskunnan paineet palveluiden karsimisesta ja niiden digitalisoinnista edellyttävät myös vammaisilta ihmisiltä tietokoneen käyttötaitoja. Oppiminen sinänsä ei tuota kaikille ongelmia, suurimmat vaikeudet liittyvät yleensä tiedonkulkuun, kommunikointiin ja monimutkaiseen tietotekniseen käyttöympäristöön. Kuurosokeat tarvitsevat enemmän aikaa tehtävien suorittamiseen ja asian ymmärtämiseen. Koulutuksen sisältöön, opetuksessa käytettäviin ohjelmiin ja etenemistahtiin vaikuttavat merkittävästi oppilaan tietokoneen käyttötapa, perustiedot ja – taidot, kuulonäkövamman aste, äidinkieli, henkilö-kohtaiset apuvälineet ja apuvälineohjelma tietokoneella. IT-ryhmäkoulutuksen opetustilanteet ovat erilaisen kommunikaation jatkuvaa soveltamista. Sosiaa-lishaptinen kommunikaatio täydentää ja korvaa visuaalista ja auditiivista viestintää ja vuorovaikutusta merkittävällä tavalla ja on oleellinen osa ryhmäkoulutusta. Haptinen ohjeistus toimii myös opetusvälineenä, tukee muuta oppimateriaalia ja oppilaiden ohjaamista ja antaa tietojenkäsittelyn opetukselle aivan uuden ulottuvuuden

Carbonic Anhydrase VI : Functional characterization in mouse and zebrafish model organisms

Hiilihappoanhydraasit (Carbonic anhydrase, CA) katalysoivat tehokkaasti käänteistä hiilidioksidin ja veden reaktiota bikarbonaatiksi ja protoniksi (CO2 + H2O - HCO3- + H+). Useimmat CA-entsyymit kuuluvat α-, β-, tai γ- luokkaan, jotka eroavat toisistaan sekä aktiivisen keskuksen että ulkoisen rakenteen osalta. CA VI on ainoa rx-luokan erittyvä entsyymi. Se havaittiin ihmisen syljestä ja yhdistettiin makuaistimukseen ensimmäistä kertaa 1970-luvulla ja nimettiin ’gustiini’ - entsyymiksi. Vuonna 1979 CA-entsyymi löydettiin lampaan sylkirauhasesta ja syljestä. Ihmisen syljestä eristetty entsyymi nimettiin CA VI:ksi vuonna 1987. Vuonna 1998 osoitettiin, että ’gustiini’ ja CA VI ovat keskenään identtisiä. Ihmisellä CA VI-entsyymiä erittyy syljen lisäksi myös maitoon. Oman tutkimukseni tarkoituksena on ollut hankkia uutta tietoa erittyvän CA-entsyymin ilmentymisestä ja toiminnasta. Tutkimuksessa käytettiin kahta koe-eläinmallia: Car6 poistogeenisiä hiiriä sekä seeprakaloja, joiden vastaava geeni oli hiljennetty morfoliinotekniikalla. Car6 poistogeenistä hiirimallia käytettiin sekä makuaistimuksen että geenien ilmentymisen tutkimiseen. Tuloksia verrattiin normaalien villin tyypin (WT) hiirten tuloksiin. Tutkimuksessa tarkasteltiin cDNA-mikrosirutekniikan avulla, miten CA VI-entsyymin poisto vaikuttaa geenien ilmentymiseen henkitorvessa ja keuhkoissa. Kahden hiiriryhmän välisiä eroja selvitettiin tilastotieteellisillä menetelmillä. Hyönteissoluissa geenitekniikan avulla tuotetun seeprakalan CA VI-proteiinin rakenteen kartoitukseen käytettiin staattista (SLS) ja dynaamista (DLS) valonsirontamenetelmää, joita ennen proteiini puhdistettiin kromatografiamenetelmillä. Massaspektrometriaa varten proteiinirakenne pilkottiin trypsiinin avulla. Proteiinirakenne, siinä esiintyvät sokerointikohdat ja sokeriosien rakenteet analysoitiin CID-MS/MS-massaspektrometrialla. Tutkimuksen eri vaiheissa tuloksina saadut nukleotidi- ja aminohapposekvenssit analysoitiin käyttämällä lukuisia bioinformatiikan työkaluja. CA VI- entsyymin merkitystä seeprakalan kehityksessä tutkittiin hiljentämällä ca6-geeni alkioista, minkä jälkeen tarkasteltiin kalojen kehitystä ja uintikäyttäytymistä. Makuaistimuskokeen tulokset osoittivat Car6-/- -hiirten suosivan veden juomisen n 0.003 mM kiniiniliuosta, kun taas WT hiiret suosivat vettä. Mikrosirumenetelmällä saadun datan analyysi osoitti geenien ilmentymiseroja sekä henkitorvessa että keuhkoissa Car6-/- poistogeenisten ja WT hiirten välillä. VLAD- analyysi osoitti muutoksia aineenvaihdunnan prosesseissa, biologisessa säätelyssä, yhden organismin prosesseissa sekä limakalvoon liittyvän kudoksen immuunivasteessa. Sekvenssianalyysi osoitti, että seeprakalan CA VI:n C-terminaalipäähän on liittynyt pentraksiiniproteiini. Valonsironta- ja geelisuodatusanalyysien tuloksena proteiini ilmenee oligomeerina, ja molekyylin koon perusteella sen voidaan arvioida esiintyvän pentameerina. Sekä CA VI- että PTX-domeeneissa on rikkisiltoja. Seeprakalan CA VI-PTX -kudosvärjäys osoitti positiivista signaalia solun pinnalta ihossa, sydämessä, kiduksissa sekä uimarakossa. ca6 geenin hiljentämisen jälkeen neljän päivän ikäiset poikaset eivät pystyneet uimaan normaalisti lähellä veden pintaa joko uimarakon hidastuneen kehittymisen tai sen täyttymiseen liittyvien ongelmien vuoksi, kun taas WT poikaset uivat normaalisti. Viiden päivän iässä ca6-hiljennettyjen poikasten uimarakko täyttyi ja uintikyky tuli normaaliksi. Poistogeenisen hiirimallin avulla osoitimme, että CA VI osallistuu karvaan maun aistimukseen. CA VI, jota erittyy runsaasti sylkeen ja maitoon voi olla yksi tekijä, joka auttaa välttämään karvaan makuisia ja mahdollisesti myrkyllisiä aineita. Seeprakalan CA VI-entsyymiin liittyvien tutkimusten avulla saatiin runsaasti uutta tietoa CA- entsyymien evoluutiosta sekä CA VI-PTX-proteiinin ilmentymisestä, rakenteesta ja toiminnasta.Carbonic anhydrases (CAs) efficiently catalyze the reversible hydration reaction of carbon dioxide (CO2 + H2O - HCO3- + H+). Major CA families belong to the α-, β-, or γ-classes and have different features in terms of both their overall structure and active site. Carbonic anhydrase VI (CA VI) is the only secreted isozyme in the rx-CA enzyme family. In the 1970s, a novel taste-associated secreted protein was identified in human saliva and named Gustin. The same protein was observed in a sheep parotid gland and saliva in 1979 and was classified as a CA based on its protein sequence. Two decades later, in 1998, Gustin was proven to be identical to the CA VI enzyme. CA VI is one of the major protein constituents of human saliva and milk. The general aim of this study was to reveal new information about the expression and function of secretory CA VI. We used two independent animal models in our studies focused on CA VI. First, a Car6 knockout mouse (KO) model was utilized to evaluate the differences in taste modalities between CA VI-deficient and wild-type (WT) mice. Then, we further investigated by cDNA microarray whether the gene expression profiles differed between KO and WT mice with a focus on the trachea and lung. Second, we used zebrafish to investigate the role and distribution of CA VI in another vertebrate animal model. The recombinant zebrafish CA VI protein was produced in insect cells. The protein was purified using chromatography methods and characterized by static and dynamic light scattering (SLS and DLS) analyses and by mass spectrometry (MS). Verification of glycosylation sites and glycan structures was carried out using Collision Induced Dissociation with Tandem Mass Spectrometry (CID-MS/MS). Sequence analysis was performed by various bioinformatics tools. The functional significance of the CA VI enzyme to zebrafish was studied by silencing the gene encoding the enzyme, and its effect on the phenotype was examined. The comparison of taste modalities showed that Car6-/- mice significantly preferred a0.003 mM quinine solution to water, whereas WT mice preferred water. The microarray data analysis results showed a number of differentially expressed genes in the trachea and lung when comparing the WT and Car6 -/- mice groups. A Gene List Analysis and Visualization tool (VLAD) analysis resulted in changes in a metabolic process, biological regulation, single-organism process, and an immune response in mucosal-associated lymphoid tissue. Sequence analysis of zebrafish CA VI showed that there was an additional pentraxin (PTX) protein attached to the C-terminus of CA VI. Light scattering combined with gel filtration analysis indicated oligomeric assembly for the protein, with a pentameric configuration being the most plausible form. Both the CA VI and PTX domains contained either intra- or interpeptide disulfide bonds. Localization analysis of CA VI-PTX in various zebrafish tissues showed the strongest positive staining signal on cell surfaces in the skin, heart, gills, and swim bladder. Underdeveloped or deflated swim bladders of CA VI-PTX knockdown (KD) larvae were observed at 4 days post fertilization (dpf), whereas fish gained the ability to inflate their swim bladder and started to swim normally at 5 dpf. Our KO mouse model confirms that CA VI is involved in bitter taste perception. As one of the major protein constituents of saliva and milk, CA VI may be one of the factors that contributes to the avoidance of bitter, potentially harmful, substances. Several findings on zebrafish CA VI give novel insights into the evolution, structure, and function of this unique CA form

Carbonic Anhydrase VI : Functional characterization in mouse and zebrafish model organisms

Hiilihappoanhydraasit (Carbonic anhydrase, CA) katalysoivat tehokkaasti käänteistä hiilidioksidin ja veden reaktiota bikarbonaatiksi ja protoniksi (CO2 + H2O - HCO3- + H+). Useimmat CA-entsyymit kuuluvat α-, β-, tai γ- luokkaan, jotka eroavat toisistaan sekä aktiivisen keskuksen että ulkoisen rakenteen osalta. CA VI on ainoa rx-luokan erittyvä entsyymi. Se havaittiin ihmisen syljestä ja yhdistettiin makuaistimukseen ensimmäistä kertaa 1970-luvulla ja nimettiin ’gustiini’ - entsyymiksi. Vuonna 1979 CA-entsyymi löydettiin lampaan sylkirauhasesta ja syljestä. Ihmisen syljestä eristetty entsyymi nimettiin CA VI:ksi vuonna 1987. Vuonna 1998 osoitettiin, että ’gustiini’ ja CA VI ovat keskenään identtisiä. Ihmisellä CA VI-entsyymiä erittyy syljen lisäksi myös maitoon. Oman tutkimukseni tarkoituksena on ollut hankkia uutta tietoa erittyvän CA-entsyymin ilmentymisestä ja toiminnasta. Tutkimuksessa käytettiin kahta koe-eläinmallia: Car6 poistogeenisiä hiiriä sekä seeprakaloja, joiden vastaava geeni oli hiljennetty morfoliinotekniikalla. Car6 poistogeenistä hiirimallia käytettiin sekä makuaistimuksen että geenien ilmentymisen tutkimiseen. Tuloksia verrattiin normaalien villin tyypin (WT) hiirten tuloksiin. Tutkimuksessa tarkasteltiin cDNA-mikrosirutekniikan avulla, miten CA VI-entsyymin poisto vaikuttaa geenien ilmentymiseen henkitorvessa ja keuhkoissa. Kahden hiiriryhmän välisiä eroja selvitettiin tilastotieteellisillä menetelmillä. Hyönteissoluissa geenitekniikan avulla tuotetun seeprakalan CA VI-proteiinin rakenteen kartoitukseen käytettiin staattista (SLS) ja dynaamista (DLS) valonsirontamenetelmää, joita ennen proteiini puhdistettiin kromatografiamenetelmillä. Massaspektrometriaa varten proteiinirakenne pilkottiin trypsiinin avulla. Proteiinirakenne, siinä esiintyvät sokerointikohdat ja sokeriosien rakenteet analysoitiin CID-MS/MS-massaspektrometrialla. Tutkimuksen eri vaiheissa tuloksina saadut nukleotidi- ja aminohapposekvenssit analysoitiin käyttämällä lukuisia bioinformatiikan työkaluja. CA VI- entsyymin merkitystä seeprakalan kehityksessä tutkittiin hiljentämällä ca6-geeni alkioista, minkä jälkeen tarkasteltiin kalojen kehitystä ja uintikäyttäytymistä. Makuaistimuskokeen tulokset osoittivat Car6-/- -hiirten suosivan veden juomisen n 0.003 mM kiniiniliuosta, kun taas WT hiiret suosivat vettä. Mikrosirumenetelmällä saadun datan analyysi osoitti geenien ilmentymiseroja sekä henkitorvessa että keuhkoissa Car6-/- poistogeenisten ja WT hiirten välillä. VLAD- analyysi osoitti muutoksia aineenvaihdunnan prosesseissa, biologisessa säätelyssä, yhden organismin prosesseissa sekä limakalvoon liittyvän kudoksen immuunivasteessa. Sekvenssianalyysi osoitti, että seeprakalan CA VI:n C-terminaalipäähän on liittynyt pentraksiiniproteiini. Valonsironta- ja geelisuodatusanalyysien tuloksena proteiini ilmenee oligomeerina, ja molekyylin koon perusteella sen voidaan arvioida esiintyvän pentameerina. Sekä CA VI- että PTX-domeeneissa on rikkisiltoja. Seeprakalan CA VI-PTX -kudosvärjäys osoitti positiivista signaalia solun pinnalta ihossa, sydämessä, kiduksissa sekä uimarakossa. ca6 geenin hiljentämisen jälkeen neljän päivän ikäiset poikaset eivät pystyneet uimaan normaalisti lähellä veden pintaa joko uimarakon hidastuneen kehittymisen tai sen täyttymiseen liittyvien ongelmien vuoksi, kun taas WT poikaset uivat normaalisti. Viiden päivän iässä ca6-hiljennettyjen poikasten uimarakko täyttyi ja uintikyky tuli normaaliksi. Poistogeenisen hiirimallin avulla osoitimme, että CA VI osallistuu karvaan maun aistimukseen. CA VI, jota erittyy runsaasti sylkeen ja maitoon voi olla yksi tekijä, joka auttaa välttämään karvaan makuisia ja mahdollisesti myrkyllisiä aineita. Seeprakalan CA VI-entsyymiin liittyvien tutkimusten avulla saatiin runsaasti uutta tietoa CA- entsyymien evoluutiosta sekä CA VI-PTX-proteiinin ilmentymisestä, rakenteesta ja toiminnasta.Carbonic anhydrases (CAs) efficiently catalyze the reversible hydration reaction of carbon dioxide (CO2 + H2O - HCO3- + H+). Major CA families belong to the α-, β-, or γ-classes and have different features in terms of both their overall structure and active site. Carbonic anhydrase VI (CA VI) is the only secreted isozyme in the rx-CA enzyme family. In the 1970s, a novel taste-associated secreted protein was identified in human saliva and named Gustin. The same protein was observed in a sheep parotid gland and saliva in 1979 and was classified as a CA based on its protein sequence. Two decades later, in 1998, Gustin was proven to be identical to the CA VI enzyme. CA VI is one of the major protein constituents of human saliva and milk. The general aim of this study was to reveal new information about the expression and function of secretory CA VI. We used two independent animal models in our studies focused on CA VI. First, a Car6 knockout mouse (KO) model was utilized to evaluate the differences in taste modalities between CA VI-deficient and wild-type (WT) mice. Then, we further investigated by cDNA microarray whether the gene expression profiles differed between KO and WT mice with a focus on the trachea and lung. Second, we used zebrafish to investigate the role and distribution of CA VI in another vertebrate animal model. The recombinant zebrafish CA VI protein was produced in insect cells. The protein was purified using chromatography methods and characterized by static and dynamic light scattering (SLS and DLS) analyses and by mass spectrometry (MS). Verification of glycosylation sites and glycan structures was carried out using Collision Induced Dissociation with Tandem Mass Spectrometry (CID-MS/MS). Sequence analysis was performed by various bioinformatics tools. The functional significance of the CA VI enzyme to zebrafish was studied by silencing the gene encoding the enzyme, and its effect on the phenotype was examined. The comparison of taste modalities showed that Car6-/- mice significantly preferred a0.003 mM quinine solution to water, whereas WT mice preferred water. The microarray data analysis results showed a number of differentially expressed genes in the trachea and lung when comparing the WT and Car6 -/- mice groups. A Gene List Analysis and Visualization tool (VLAD) analysis resulted in changes in a metabolic process, biological regulation, single-organism process, and an immune response in mucosal-associated lymphoid tissue. Sequence analysis of zebrafish CA VI showed that there was an additional pentraxin (PTX) protein attached to the C-terminus of CA VI. Light scattering combined with gel filtration analysis indicated oligomeric assembly for the protein, with a pentameric configuration being the most plausible form. Both the CA VI and PTX domains contained either intra- or interpeptide disulfide bonds. Localization analysis of CA VI-PTX in various zebrafish tissues showed the strongest positive staining signal on cell surfaces in the skin, heart, gills, and swim bladder. Underdeveloped or deflated swim bladders of CA VI-PTX knockdown (KD) larvae were observed at 4 days post fertilization (dpf), whereas fish gained the ability to inflate their swim bladder and started to swim normally at 5 dpf. Our KO mouse model confirms that CA VI is involved in bitter taste perception. As one of the major protein constituents of saliva and milk, CA VI may be one of the factors that contributes to the avoidance of bitter, potentially harmful, substances. Several findings on zebrafish CA VI give novel insights into the evolution, structure, and function of this unique CA form

Tietojenkäsittelyn opetus kosketuksen avulla

Suomen Kuurosokeat ry:n Tieto- ja viestintäteknologian tukipalveluiden IT-koulutuksessa käytetään osana ryhmäkoulutusta toiminnallista näköä ja kuuloa täydentäviä tuntoaistiin perustuvia kuvailu-, palaute- ja ohjeistustapoja tietojenkäsittelyn opetuksessa. Niillä täydennetään ja/tai korvataan kuulonäkövammaisten asiakkaiden kuulon ja/tai näön kautta saamaa tietoa. Olen työskennellyt Suomen Kuurosokeat ry:n Tieto- ja viestintäteknologian tukipalveluissa IT-kouluttajana vuodesta 2007 lähtien ja kuulun kouluttajatiimiin, jossa lisäkseni työskentelee toinen IT-kouluttaja ja viestintäkouluttaja. Tutkimukseni on laadullinen toimintatutkimus. Tutkimus on tehty vuonna 2015 ja sen tarkoitus on kuvata, kuinka IT-koulutuksen kehittämä ryhmäkoulutusmalli käytännössä toteutuu ja millä tavalla tuntoaistiin perustuvat menetelmät toimivat opetustilanteessa. Tiedonkeruumenetelmä on videointi. Aineistona olen käyttänyt IT-ryhmäkoulutuksen koulutusviikoilla kevään 2015 aikana kuvaamiani videoita opetustilanteista. Kuurosokea on henkilö, joka ei näe eikä kuule lainkaan. Nimitystä käytetään myös henkilöistä, joilla on jonkin verran jäljellä olevaa toiminnallista näköä ja/tai kuuloa. Ympäröivän yhteiskunnan paineet palveluiden karsimisesta ja niiden digitalisoinnista edellyttävät myös vammaisilta ihmisiltä tietokoneen käyttötaitoja. Oppiminen sinänsä ei tuota kaikille ongelmia, suurimmat vaikeudet liittyvät yleensä tiedonkulkuun, kommunikointiin ja monimutkaiseen tietotekniseen käyttöympäristöön. Kuurosokeat tarvitsevat enemmän aikaa tehtävien suorittamiseen ja asian ymmärtämiseen. Koulutuksen sisältöön, opetuksessa käytettäviin ohjelmiin ja etenemistahtiin vaikuttavat merkittävästi oppilaan tietokoneen käyttötapa, perustiedot ja – taidot, kuulonäkövamman aste, äidinkieli, henkilö-kohtaiset apuvälineet ja apuvälineohjelma tietokoneella. IT-ryhmäkoulutuksen opetustilanteet ovat erilaisen kommunikaation jatkuvaa soveltamista. Sosiaa-lishaptinen kommunikaatio täydentää ja korvaa visuaalista ja auditiivista viestintää ja vuorovaikutusta merkittävällä tavalla ja on oleellinen osa ryhmäkoulutusta. Haptinen ohjeistus toimii myös opetusvälineenä, tukee muuta oppimateriaalia ja oppilaiden ohjaamista ja antaa tietojenkäsittelyn opetukselle aivan uuden ulottuvuuden

Pentraxin -Carbonic anhydrase CA VI: A novel multidomain protein

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Hiilihappoanhydraasi- proteiinit (carbonic anhydrases, CAs) toimivat kudoksien ja nesteiden pH:n säätelyssä katalysoiden CO2 + H2O   HCO3− + H+ reaktiota. Hiilihappoanhydraasit ovat eliölajeille tärkeitä proteiineja, joiden rakenne ja toimintaympäristö vaihtelevat eri isoentsyymeillä. CA VI on erittyvä proteiini, jota on löydetty syljestä ja äidinmaidosta. CA VI – proteiiniin mm. sammakoilla, kaloilla ja kanalla on kiinnittynyt pentraksiinidomeeni, jonka tarkkaa merkitystä ei vielä tiedetä. Työn tavoitteena on tutkia hiilihappoanhydraasi VI -entsyymin esiintyvyyttä eri lajeilla, rakennetta ja rakenteen konservoituneisuutta eri lajien kesken bioinformatiikan menetelmin. Tavoitteena on valmistaa konstrukti proteiinin tuottamista varten bakteeri- ja hyönteissoluissa käyttäen molekyylibiologian menetelmiä, sekä tutkia miten CA6 geenin hiljentäminen vaikuttaa alkuvaiheen kehityksessä seeprakalojen fenotyyppiin.Tutkimusmenetelmät: Tietokannoista löytyvien CA VI proteiinisekvenssien tarkastelu toteutettiin bioinformatiikan menetelmillä. Molekyylibiologisia menetelmiä käyttäen valmistettiin konstrukti seeprakalan CA VI proteiinin tuottoa varten. Seeprakalojen fenotyyppejä vertailtiin alkioiden kehityksen vaiheiden tutkimuksessa histologian menetelmin. Tutkimustulokset: Sekvenssien rinnastus ja rakenteen analyysit osoittivat kohtia, joissa oli useampia konservoituneita aminohappoja. Yksi konservoituneista alueista sisälsi monille lajeille yhteisen glykosylaatiokohdan. Proteiinin 3D rakenteella tarkasteltuna havaittiin proteiinin aktiivisen kohdan voimakas konservoituminen eri lajien kesken. Proteiinin tuottoa varten valmistettiin konstrukti, jonka sisältämän seeprakalan CA VI -proteiinin nukleotidisekvenssi varmistettiin. Seeprakalojen CA6 geenin hiljentämisen jälkeen alkioiden ja kehittyvien poikasten näytteissä ilmeni morfologisia muutoksia uimarakkulassa ja vatsan alueella.Johtopäätökset: Analyysit vahvistivat CA VI proteiinin olevan eritetty proteiini, johon on liittynyt signaalipeptidi. Konservoituneiden aminohappojen joukosta löytyi alue, jossa useimmista sekvensseistä löytyy kohta glykosylaatiolle. Rakenteen 3D malli osoitti hyvin sekvenssien konservoituneet alueet. Muutamilla lajeilla CA VI proteiiniin liittyneen pentraksiinin toimintaa ei vielä tunneta. Proteiinin tuottoa varten tehtiin konstrukti, jonka CA VI proteiinia koodaava sekvenssi todettiin bioinformatiikan menetelmällä oikeaksi. Seeprakaloilla CA6 geenin hiljentäminen aiheutti epämuodostumia uimarakon ja vatsan alueella.  ABSTRACTBackground and aims: Carbonic anhydrases (CAs) participate in the maintenance of pH homeostasis catalyzing the reversible hydration of carbon dioxide CO2 + H2O   HCO3− + H+. CAs is fundamental to a wide array of physiological processes in species and driving the diversification of CA isoforms in different environments. The CA VI is a secreted protein, found in saliva and breast milk. In some species, such as frogs, fish and chicken a part called pentraxin is attached to CA VI – protein. A function of this pentraxin is not known. In the present study, we investigated the characteristics of CA VI in different species.  The alignment of sequences, the structure of protein and conservation among different species were observed using bioinformatics methods. The other focus on this study was to build a construct for zebrafish CA VI protein production in bacterial and insect cells and to observe the knockdown zebrafish embryonic development in early states using molecular biology and histological methods.Methods: The CA VI protein sequences found in the databases aligned and studied with bioinformatics methods. The molecular biology methods used to build the construct for the protein production of zebrafish CA VI and to study the knockdown effect in zebrafish embryos. Results: The alignment and the analysis of CA VI structure showed the regions of conserved amino acids in different species. One of these regions included the N-glycosylation site found in most of the studied sequences. The study of the 3D structure showed strong conservation at the active site of the protein. The construct has built for the zebrafish CA VI protein production. The template sequence of the construct verified with sequencing. The samples from the CA6 knockdown zebrafish embryos and fry showed changes in morphology of the swim bladder and the stomach area.Conclusions: The analysis confirms that the CA VI is a secreted protein having a signal peptide, and the N-glycosylation site predictions gave novel information about the conserved N-glycosylation site found in different species sequences. The visualizing tool proved to be very helpful of showing the conserved regions in 3D structure. The function of the attached pentraxin part remains unknown. A construct for zebrafish CA VI protein production was produced. The sequencing results verified with bioinformatics methods that the template codes the correct CA VI protein. The morphology results showed the malformation of the swim bladder and stomach area of the CA6 knockdown zebrafish